這篇文章Kaustubh Kishor Jadhav撰寫的，今天先分享的是他的上一段，關于細胞支原體污染的原因和怎么檢測細胞支原體污染，他是米高梅生物科學與技術研究所的研究助理。

如果你正在閱讀這篇文章，如果你的實驗室里有支原體，不要驚訝。因為它們存在于大多數細胞培養(yǎng)設施、組織培養(yǎng)實驗室中，是每個細胞培養(yǎng)工作者必須解決的問題。據估計，高達60%的細胞培養(yǎng)污染是支原體污染（Uphoff，2002年統(tǒng)計）。

支原體被認為是最是簡單、最小的細菌之一。缺乏堅硬的細胞壁使它們對抗生素和抗菌藥物如青霉素和鏈霉素產生耐藥性。支原體可以通過過濾器，因為它能夠變成任何形狀以黏附在細胞壁上。

支原體污染的原因

支原體通過各種難以追蹤的來源進入細胞培養(yǎng)。這些包括實驗室人員、血清、細胞培養(yǎng)基、水浴、培養(yǎng)箱等。人類支原體污染是上述污染的最大來源。污染物可以通過臟衣服、實驗服、以及層流氣流附近的會語、頭皮屑、打噴嚏、咳嗽等傳播。此外，無論在哪里保存細胞培養(yǎng)物，持續(xù)不斷的個體流動都會增加污染的風險。

由于實驗室的設備落后以及節(jié)約成本等原因，支原體可以通過交叉污染從這些來源傳播，這包括對多個細胞系重復使用移液管，而不是使用一次性移液管或重復使用手套。血清也是支原體污染的來源。由于其渾濁的性質，污染是很難檢測到的血清，這是較為常用的每種細胞培養(yǎng)。重復使用同一瓶血清可促進支原體的生長。血清營養(yǎng)豐富，也是支原體增殖的最佳來源。另外，它是在高壓滅菌后添加到培養(yǎng)基中的，因此，不能保證血清無污染。

在層流氣流倉中工作時（說話或移液時）產生的氣溶膠也是造成污染的主要原因之一。在傳代培養(yǎng)過程中，這些產生的氣溶膠將進入培養(yǎng)基，如果細胞系暴露時間較長，這些氣溶膠將從空氣中進入細胞。這些氣溶膠肉眼看不見，因此在導致污染之前無法被檢測到。

問題的另一個來源是用于傳代培養(yǎng)的培養(yǎng)基，它有液體和粉末兩種形式。由于處理不當或實驗室環(huán)境不好，支原體可以通過這種粉狀培養(yǎng)基傳播。過濾不能確保*滅菌，因為支原體甚至可以逃逸0.2微米的過濾器。

支原體可以在干燥狀態(tài)下保持較長時間。當它們接觸到營養(yǎng)源時，很快就會開始增殖。一旦它們出現在實驗室環(huán)境中，就很難*。你可以抑制支原體的生長，但不能**它。當支原體出現在培養(yǎng)基中時，丟棄培養(yǎng)源是一個很好的選擇（除非培養(yǎng)源不可替代或價格昂貴）。

怎么檢測細胞支原體

用肉眼或光學顯微鏡檢測支原體是非常困難的，那么你怎么知道它在那里呢？您可以使用PCR的檢測、DNA染色、熒光標記、瓊脂平板等。明智地選擇下面列出的任何一種技術，并始終使用第二次分析來確定。在檢測支原體之前，細胞應連續(xù)培養(yǎng)至少兩周，以便有時間讓低濃度的污染物生長。對于試驗，取樣前至少兩天或三天不應更換培養(yǎng)基（Uphoff和Drexler，2011）。

軟瓊脂培養(yǎng)被認為是檢測支原體的“金標準"。在這種方法中，細胞培養(yǎng)的上清液被加入液體或半固體培養(yǎng)基（含有支原體生長所必需的營養(yǎng)素）。受感染的細胞在含有培養(yǎng)基的瓊脂平板上都會生長。支原體菌落在瓊脂平板上很容易看到。除少數支原體外，該方法能檢測大多數支原體。

另一種用于支原體檢測的方法是PCR。在這項技術中，針對各種常見感染支原體的16sRNA基因的PCR引物被使用。廣泛的引物包含幾乎所有可感染的支原體。過程中使用的引物要么是物種/基因特異性的，要么是通用的。該方法快速、高效、可靠且效益高（Sung，2006）。

顯色法檢測細胞支原體。一旦檢測到支原體，試劑就會引發(fā)一系列的化學反應，從而引起明顯的顏色變化。該方法靈敏度高，特異性低（Degeling，2012）。

生物發(fā)光檢測試劑盒可從不同的生物技術公司獲得，這些公司是基于酶的支原體檢測試劑盒。這些試劑盒檢測的支原體酶不是由真核細胞合成。首先，試劑盒的成分使支原體破裂，然后使用特定的酶來觸發(fā)產生發(fā)光的細胞機制，然后通過光度計檢測到。

感染培養(yǎng)基中可加入非特異性DNA染色劑檢測支原體。當在熒光顯微鏡下觀察時，支原體DNA除了細胞DNA外，還以小簇的形式出現。

熒光DNA染色是另一種DNA染色方法。這種方法使用像DAPI和hoechst33258這樣的DNA染色劑來染色所有的DNA。在這個過程中需要一些專業(yè)知識，因為結果解釋可能很困難。支原體的低密度、其他細菌的污染或這些細菌產生的細胞外熒光信號都會妨礙正確的結果解釋。此外，來自核區(qū)的信號使支原體的檢測變得困難（Ligasová，2019）。這種方法一般不建議使用。