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    雙重染色法免疫熒光組織化學(xué)染色步驟

    發(fā)布時(shí)間: 2021-10-26  點(diǎn)擊次數(shù): 4239次
    材料與儀器:

    原代培養(yǎng)胚胎14天大鼠端腦細(xì)胞,F(xiàn)ITC,TRITC 


    實(shí)驗(yàn)步驟:
    雙重染色法免疫熒光組織化學(xué)染色步驟
    若在同一標(biāo)本中有兩A和B種抗原需要同時(shí)顯示,A抗原的抗體用FITC標(biāo)記,B抗原的抗體用TRITC標(biāo)記,可采用以下染色方法:
    雙重染色法免疫熒光組織化學(xué)染色步驟
    免疫熒光細(xì)胞化學(xué)雙重染魚(yú)法
    原代培養(yǎng)胚胎14天大鼠端腦細(xì)胞:在骨發(fā)生形態(tài)蛋白―{誘導(dǎo)下,乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(呈綠色熒光)和同源域蛋白Islet―1(呈紅色熒光)共存于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(激光掃描共聚焦顯微鏡觀察)
    1.一步雙染色法先將兩種熒光標(biāo){己抗體按適當(dāng)比例混合(A+B),按直接法進(jìn)行染色。
    2.二步雙染色法先用TRITC標(biāo)記的A抗體進(jìn)行免疫熒光染色,再用FITC標(biāo)記的B抗體染色,根據(jù)兩種抗體的動(dòng)物種屬不同,可用直接法也可用間接法,結(jié)果A抗原呈現(xiàn)橘紅色熒光,而B(niǎo)抗原呈現(xiàn)黃綠色熒光。在應(yīng)用中,常用的方法是免疫熒光組織化學(xué)中間接法和SABC-Cy3法相結(jié)合。例如,在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí),選擇小鼠抗大鼠A和兔抗大鼠B作為兩種不同的特異性一抗,相匹配的二抗分別為FITC-抗小鼠IgG和生物素化―抗兔IgG。
    進(jìn)行雙重染色時(shí),由于兩種一抗種屬來(lái)源不同,可把一抗混合使用。孵育結(jié)束后洗滌未結(jié)合的一抗,滴加二抗時(shí),先加人生物素化―抗兔IgG(二抗)孵育,洗滌后,滴加SABC-Cy3復(fù)合物,經(jīng)熒光顯微鏡下觀察已出現(xiàn)特異性熒光,再進(jìn)行FITC―抗小鼠IgG(二抗)的孵育,最后封片觀察。其結(jié)果A抗原呈現(xiàn)綠色熒光,B抗原呈現(xiàn)紅色熒光。
    此法應(yīng)注意兩種一抗在混合稀釋時(shí),抗體的終濃度應(yīng)為每一種抗體的工作濃度。換言之,混合后的液體要同時(shí)滿足兩種一抗的工作濃度。若兩種一抗種屬來(lái)源相同,必須分兩次進(jìn)行雙重染色,即先用第一種一抗和第一種熒光二抗對(duì)A抗原進(jìn)行染色,洗滌后,用第二種一抗和第二種熒光二抗對(duì)B抗原進(jìn)行染色,否則會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)而使染色無(wú)特異性。



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